分子医学技能- 实验二PCR 试剂盒检测HBV DNA apoB 基因检测PCR 基本原理及相关知识聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR ）是一种体外扩增特异DNA 片断的技术, 能在短时间内获得数百万个特异DNA 序列的拷贝。Kary Mullis PCR 技术最早由美国 Cetus 公司人类遗传研究室Kary Mullis 及同事于1985 年发现并研制成功的。Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993 年度诺贝尔化学奖。 相对DNA 克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。 PCR 扩增DNA 片段的原理 PCR 是在模板DNA 、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步： ① 变性：加热，模板DNA 形成两条单链 ② 退火：降温，模板单链DNA 与引物配对结合 ③ 延伸：在DNA 聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3'- 端向前延伸，合成与模板配对的新链 上述三步为一个循环，经过一个循环DNA 量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30 个循环后目的DNA就可以扩增106~109 倍。 通过循环可以提高PCR 的特异性。PCR 反应体系的组成及功能 完整的PCR 反应体系包括：模板： 单、双链DNA 均可，不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白类。相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR 对DNA 模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为102~104 拷贝模板就可以满足要求。一般100ng DNA 模板/100L 。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。引物 是预扩增DNA 片段两端的已知序列，是保证 PCR 特异性的关键因素，引物浓度：0.1-0.5 mol/L ， 浓度过高易导致模板与引物错配, 反应特异性下降。Taq DNA 聚合酶 有良好的热稳定性，具有5‘-3’ 聚合酶活性和3‘-5’ 外切酶活性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功能。 其活性对Mg2+ 浓度非常敏感 终浓度一般为：2.5u/100ul ，酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。 dNTP ： 已有商品化的混合液，终浓度一般为20~200umol/L 。10×PCR 反应buffer ： 已作成商品化的产品，它包括： 250~500mmol/L KCl ； 100~500mmol/LTris-HAC （pH8.4 ）；15~20mmol/L MgCl2 （对Taq 酶的活性影响很大，一般浓度为...
